神經(jīng)領(lǐng)域?qū)嶒炏嚓P(guān)問題
A.答案
轉(zhuǎn)基因動物依賴的基因重組能夠?qū)崿F(xiàn)高效且特意的基因重組,但由于轉(zhuǎn)基因動物難易獲得、動物交配需要大量耗時(至少2代交配才能獲得基因敲除動物)且區(qū)域或組織特異性不高(僅依賴啟動子調(diào)控)。
A.答案
(1)有效注射范圍:HRP的注射范圍從注射中心向周圍擴散,濃度遞減。其注射區(qū)的有效范圍是難以確定的問題,故影響對結(jié)果的分析。一般認(rèn)為注射中心深染而不能辯明其結(jié)構(gòu)的區(qū)域為有效區(qū),而其周圍可辨標(biāo)記細(xì)胞的區(qū)域則為無效區(qū)。
(2)過路纖維問題:路經(jīng)注射區(qū)的纖維也可攝取HRP并被順、逆向運送。因此,標(biāo)記部位所出現(xiàn)的神經(jīng)元或終末,可能并非起于或終止于注射部位。這是在分析結(jié)果時經(jīng)常遇到的問題。
(3)側(cè)支標(biāo)記:HRP標(biāo)記被一軸突末梢攝入后,在其被逆向運送過程中,有一些可以沿該軸突的側(cè)支被順向運至側(cè)支的末梢,在側(cè)支的末梢部造成終末標(biāo)記。因此,在一個部位發(fā)現(xiàn)終末標(biāo)記,并不一定說明發(fā)出這些纖維的胞體位于注射區(qū)內(nèi)。
(4)跨突觸標(biāo)記:HRP被運至末梢后,可能被釋放出來,并被下一級神經(jīng)元攝入,甚至再運送至下一級神經(jīng)元的末梢。這種現(xiàn)象不多見,主要見于用較靈敏的WGA- HRP作追蹤劑時,而且是在第一級末梢密集,并與第二級神經(jīng)元的關(guān)系密切的情況下出現(xiàn)。例如,視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞末梢內(nèi)的HRP可能跨突觸地標(biāo)記外側(cè)膝狀體神經(jīng)元。
A.答案
(1)神經(jīng)元以外的其它細(xì)胞:在注射部位及其附近的膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等可攝入HRP,經(jīng)反應(yīng)而著色。這對追蹤遠(yuǎn)距離纖維聯(lián)系的影響較小,但對短距離聯(lián)系的研究卻有妨礙。一般根據(jù)其細(xì)胞形狀,尤其是核的形態(tài)及其與血管腔的關(guān)系等,易于與神經(jīng)細(xì)胞區(qū)別,而且這些細(xì)胞中的反應(yīng)顆粒常較粗大而大小不均,胞漿也常均勻著色。但有時也可造成鑒別困難,尤其是只有單個細(xì)胞時。
(2)神經(jīng)元的內(nèi)源性物質(zhì):有的神經(jīng)元含有脂褐素,隨年齡之增長而增多,可能與DAB反應(yīng)顆?;煜谟媒褂妥蠌?fù)染的切片上,其暗視野效應(yīng)還可能加強。在鼠、猴發(fā)現(xiàn)某些神經(jīng)元內(nèi)可能含有某種內(nèi)源性酶或其它物質(zhì),也可與DAB-H2O2起反應(yīng),產(chǎn)生棕色反應(yīng)物。黑色素或其前身也有類似反應(yīng)。這些物質(zhì)都可能成為偽象的來源。因此,對此法之結(jié)果的評定應(yīng)持慎重態(tài)度。
A.答案
(1)路徑選擇:熒光素也可用于順行示蹤,但標(biāo)記較弱,因此不推薦。
(2)標(biāo)記方法:不同熒光素具有不同激發(fā)波長和發(fā)射波長,故可使用雙標(biāo)或多重標(biāo)記的方法進行標(biāo)記。但不同熒光素逆行運輸速度差別較大,實驗時可分兩次手術(shù)注入熒光素。
(3)擴散問題:有些熒光素在到達(dá)胞體后有擴散出神經(jīng)元胞體而染出其周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的傾向,因此適當(dāng)存活時間的選擇很重要。
(4)有效注射部位:由于熒光素分子量較小,逆行示蹤更易擴散,故比HRP法更難確定有效注射部位。同時也存在存在過路纖維攝入問題,分析結(jié)果時需要額外注意。
(5)褪色問題:熒光素在激發(fā)光照射下較快褪色,因此允許觀察的時間短。即使在低溫、避光條件下,切片保存時間仍有限,不能長期保存。
(6)優(yōu)化方法:在50 %甘油和50 %的PBS混合液配制的封片劑中加入2.5%三乙烯二胺(triethylene diamine)可有效地延長觀察和保存時間。也可將熒光素包裹在乳膠微球內(nèi)作追蹤劑,減弱擴散、過路纖維和褪色較快的問題。
A.答案
誘導(dǎo)型 Cre-loxP 系統(tǒng)介導(dǎo)了時間特異性基因敲除,通過對給予誘導(dǎo)劑的時間的控制,人為操控基因敲除的發(fā)生。
(1)四環(huán)素誘導(dǎo)型 tetO-Cre
將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)與Cre-loxP系統(tǒng)相結(jié)合,一般需要兩種轉(zhuǎn)基因小鼠交配使用,即 Cre 工具鼠和rtTA或 tTA小鼠。
在此過程中,具有轉(zhuǎn)錄激活功能的rtTA或者tTA與tetO結(jié)合后激活Cre的表達(dá)。同時,這種結(jié)合受四環(huán)素或四環(huán)素衍生物強力霉素(Dox)的調(diào)節(jié),因此在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA (或 tTA )雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠中,可以通過給予或撤離 Dox 來控制 Cre 重組酶在特定組織中產(chǎn)生的時間。
(2)干擾素誘導(dǎo)型 Mx1-Cre
干擾素誘導(dǎo)是通過 Mx1 基因啟動子對于干擾素的響應(yīng)來實現(xiàn)的。此方法僅限于響應(yīng)干擾素的細(xì)胞,且其基因敲除效率依賴于組織或細(xì)胞對干擾素的響應(yīng)水平或干擾素響應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。
(3)雌激素誘導(dǎo)型 Cre-ER
將雌激素受體(ER)的配體結(jié)合區(qū)與 Cre 重組酶相融合,形成定位于胞漿中的融合蛋白(Cre-ER)。這樣就通過控制雌激素的注射時間,可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調(diào)控。為了避免內(nèi)源雌激素的干擾,在人ER的配體結(jié)合區(qū)進行一個點突變(G521R),使 Cre-ER 只響應(yīng)外源的人工合成雌激素(比如:Tamoxifen、4-OHT)的誘導(dǎo)。
A.答案
剌激頻率和強度和病毒沒有關(guān)系,是研究的問題決定的,一般剌激胞體強度5-10 mW,軸突10-l5 mW ,頻率和剌激的細(xì)胞特性有關(guān), 5-60 hz不等。
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