神經(jīng)領(lǐng)域?qū)嶒炏嚓P(guān)問題
A.答案
轉(zhuǎn)基因動物依賴的基因重組能夠?qū)崿F(xiàn)高效且特意的基因重組，但由于轉(zhuǎn)基因動物難易獲得、動物交配需要大量耗時（至少2代交配才能獲得基因敲除動物）且區(qū)域或組織特異性不高（僅依賴啟動子調(diào)控）。
A.答案
（1）有效注射范圍：HRP的注射范圍從注射中心向周圍擴散，濃度遞減。其注射區(qū)的有效范圍是難以確定的問題，故影響對結(jié)果的分析。一般認(rèn)為注射中心深染而不能辯明其結(jié)構(gòu)的區(qū)域為有效區(qū)，而其周圍可辨標(biāo)記細(xì)胞的區(qū)域則為無效區(qū)。
（2）過路纖維問題：路經(jīng)注射區(qū)的纖維也可攝取HRP并被順、逆向運送。因此，標(biāo)記部位所出現(xiàn)的神經(jīng)元或終末，可能并非起于或終止于注射部位。這是在分析結(jié)果時經(jīng)常遇到的問題。
（3）側(cè)支標(biāo)記：HRP標(biāo)記被一軸突末梢攝入后，在其被逆向運送過程中，有一些可以沿該軸突的側(cè)支被順向運至側(cè)支的末梢，在側(cè)支的末梢部造成終末標(biāo)記。因此，在一個部位發(fā)現(xiàn)終末標(biāo)記，并不一定說明發(fā)出這些纖維的胞體位于注射區(qū)內(nèi)。
（4）跨突觸標(biāo)記：HRP被運至末梢后，可能被釋放出來，并被下一級神經(jīng)元攝入，甚至再運送至下一級神經(jīng)元的末梢。這種現(xiàn)象不多見，主要見于用較靈敏的WGA- HRP作追蹤劑時，而且是在第一級末梢密集，并與第二級神經(jīng)元的關(guān)系密切的情況下出現(xiàn)。例如，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞末梢內(nèi)的HRP可能跨突觸地標(biāo)記外側(cè)膝狀體神經(jīng)元。
A.答案
（1）神經(jīng)元以外的其它細(xì)胞：在注射部位及其附近的膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等可攝入HRP，經(jīng)反應(yīng)而著色。這對追蹤遠(yuǎn)距離纖維聯(lián)系的影響較小，但對短距離聯(lián)系的研究卻有妨礙。一般根據(jù)其細(xì)胞形狀，尤其是核的形態(tài)及其與血管腔的關(guān)系等，易于與神經(jīng)細(xì)胞區(qū)別，而且這些細(xì)胞中的反應(yīng)顆粒常較粗大而大小不均，胞漿也常均勻著色。但有時也可造成鑒別困難，尤其是只有單個細(xì)胞時。
（2）神經(jīng)元的內(nèi)源性物質(zhì)：有的神經(jīng)元含有脂褐素，隨年齡之增長而增多，可能與DAB反應(yīng)顆?；煜谟媒褂妥蠌?fù)染的切片上，其暗視野效應(yīng)還可能加強。在鼠、猴發(fā)現(xiàn)某些神經(jīng)元內(nèi)可能含有某種內(nèi)源性酶或其它物質(zhì)，也可與DAB-H2O2起反應(yīng)，產(chǎn)生棕色反應(yīng)物。黑色素或其前身也有類似反應(yīng)。這些物質(zhì)都可能成為偽象的來源。因此，對此法之結(jié)果的評定應(yīng)持慎重態(tài)度。
A.答案
（1）路徑選擇：熒光素也可用于順行示蹤，但標(biāo)記較弱，因此不推薦。
（2）標(biāo)記方法：不同熒光素具有不同激發(fā)波長和發(fā)射波長，故可使用雙標(biāo)或多重標(biāo)記的方法進行標(biāo)記。但不同熒光素逆行運輸速度差別較大，實驗時可分兩次手術(shù)注入熒光素。
（3）擴散問題：有些熒光素在到達(dá)胞體后有擴散出神經(jīng)元胞體而染出其周圍神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的傾向，因此適當(dāng)存活時間的選擇很重要。
（4）有效注射部位：由于熒光素分子量較小，逆行示蹤更易擴散，故比HRP法更難確定有效注射部位。同時也存在存在過路纖維攝入問題，分析結(jié)果時需要額外注意。
（5）褪色問題：熒光素在激發(fā)光照射下較快褪色，因此允許觀察的時間短。即使在低溫、避光條件下，切片保存時間仍有限，不能長期保存。
（6）優(yōu)化方法：在50 %甘油和50 %的PBS混合液配制的封片劑中加入2.5%三乙烯二胺（triethylene diamine）可有效地延長觀察和保存時間。也可將熒光素包裹在乳膠微球內(nèi)作追蹤劑，減弱擴散、過路纖維和褪色較快的問題。
A.答案
誘導(dǎo)型 Cre-loxP 系統(tǒng)介導(dǎo)了時間特異性基因敲除，通過對給予誘導(dǎo)劑的時間的控制，人為操控基因敲除的發(fā)生。
（1）四環(huán)素誘導(dǎo)型 tetO-Cre
將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)與Cre-loxP系統(tǒng)相結(jié)合，一般需要兩種轉(zhuǎn)基因小鼠交配使用，即 Cre 工具鼠和rtTA或 tTA小鼠。
在此過程中，具有轉(zhuǎn)錄激活功能的rtTA或者tTA與tetO結(jié)合后激活Cre的表達(dá)。同時，這種結(jié)合受四環(huán)素或四環(huán)素衍生物強力霉素（Dox）的調(diào)節(jié)，因此在 tetO-Cre 與組織特異性 rtTA （或 tTA ）雙轉(zhuǎn)基因陽性小鼠中，可以通過給予或撤離 Dox 來控制 Cre 重組酶在特定組織中產(chǎn)生的時間。
（2）干擾素誘導(dǎo)型 Mx1-Cre
干擾素誘導(dǎo)是通過 Mx1 基因啟動子對于干擾素的響應(yīng)來實現(xiàn)的。此方法僅限于響應(yīng)干擾素的細(xì)胞，且其基因敲除效率依賴于組織或細(xì)胞對干擾素的響應(yīng)水平或干擾素響應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量。
（3）雌激素誘導(dǎo)型 Cre-ER
將雌激素受體（ER）的配體結(jié)合區(qū)與 Cre 重組酶相融合，形成定位于胞漿中的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就通過控制雌激素的注射時間，可以實現(xiàn)對基因重組時間特異性的調(diào)控。為了避免內(nèi)源雌激素的干擾，在人ER的配體結(jié)合區(qū)進行一個點突變（G521R），使 Cre-ER 只響應(yīng)外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的誘導(dǎo)。
A.答案
剌激頻率和強度和病毒沒有關(guān)系，是研究的問題決定的，一般剌激胞體強度5-10 mW，軸突10-l5 mW ，頻率和剌激的細(xì)胞特性有關(guān)， 5-60 hz不等。
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